PCR எதிர்வினைகளில் குறுக்கீடு காரணிகள்

PCR எதிர்வினையின் போது, ​​சில குறுக்கீடு காரணிகள் அடிக்கடி சந்திக்கப்படுகின்றன.
PCR இன் மிக அதிக உணர்திறன் காரணமாக, மாசுபாடு PCR முடிவுகளை பாதிக்கும் மிக முக்கியமான காரணிகளில் ஒன்றாக கருதப்படுகிறது மற்றும் தவறான நேர்மறையான முடிவுகளை உருவாக்கலாம்.
தவறான-எதிர்மறை முடிவுகளுக்கு வழிவகுக்கும் பல்வேறு ஆதாரங்களும் சமமாக முக்கியமானவை. பிசிஆர் கலவையின் ஒன்று அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட அத்தியாவசியப் பகுதிகள் அல்லது பெருக்க வினையே தடுக்கப்பட்டால் அல்லது குறுக்கீடு செய்தால், கண்டறியும் மதிப்பீடு தடைபடலாம். இது செயல்திறன் குறைவதற்கும் தவறான எதிர்மறையான முடிவுகளுக்கும் கூட வழிவகுக்கும்.
தடுப்புக்கு கூடுதலாக, மாதிரி தயாரிப்பதற்கு முன் கப்பல் மற்றும்/அல்லது சேமிப்பு நிலைமைகள் காரணமாக இலக்கு நியூக்ளிக் அமில ஒருமைப்பாடு இழப்பு ஏற்படலாம். குறிப்பாக, அதிக வெப்பநிலை அல்லது போதுமான சேமிப்பு செல்கள் மற்றும் நியூக்ளிக் அமிலங்களின் சேதத்திற்கு வழிவகுக்கும். செல் மற்றும் திசு பொருத்துதல் மற்றும் பாரஃபின் உட்பொதித்தல் ஆகியவை டிஎன்ஏ துண்டு துண்டாக மற்றும் ஒரு தொடர்ச்சியான பிரச்சனைக்கு நன்கு அறியப்பட்ட காரணங்கள் (படங்கள் 1 மற்றும் 2 ஐப் பார்க்கவும்). இந்த சந்தர்ப்பங்களில், உகந்த தனிமைப்படுத்தல் மற்றும் சுத்திகரிப்பு கூட உதவாது.

படம் 1 | டிஎன்ஏ ஒருமைப்பாடு மீது அசையாமையின் விளைவு
அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ், பிரேத பரிசோதனையின் பாரஃபின் பிரிவுகளிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட டிஎன்ஏவின் தரம் கணிசமாக வேறுபடுகிறது என்பதைக் காட்டுகிறது. வெவ்வேறு சராசரி துண்டு நீளங்களின் டிஎன்ஏ நிர்ணய முறையைப் பொறுத்து சாற்றில் இருந்தது. டிஎன்ஏ பூர்வீக உறைந்த மாதிரிகள் மற்றும் பஃபர் செய்யப்பட்ட நியூட்ரல் ஃபார்மலினில் பொருத்தப்பட்டால் மட்டுமே பாதுகாக்கப்படுகிறது. வலுவான அமிலத்தன்மை கொண்ட Bouin fixative அல்லது unbuffered, formic acid-containing formalin ஐப் பயன்படுத்துவதால் DNA கணிசமான இழப்பு ஏற்பட்டது. மீதமுள்ள பகுதி மிகவும் துண்டு துண்டாக உள்ளது.
இடதுபுறத்தில், துண்டுகளின் நீளம் கிலோபேஸ் ஜோடிகளில் (kbp) வெளிப்படுத்தப்படுகிறது.

படம் 2 | நியூக்ளிக் அமில இலக்குகளின் ஒருமைப்பாடு இழப்பு
(அ) ​​இரு இழைகளிலும் 3′-5′ இடைவெளி இருந்தால் இலக்கு டிஎன்ஏவில் முறிவு ஏற்படும். டிஎன்ஏவின் தொகுப்பு இன்னும் சிறிய துண்டில் ஏற்படும். இருப்பினும், டிஎன்ஏ துண்டில் ஒரு ப்ரைமர் அனீலிங் தளம் இல்லை என்றால், நேரியல் பெருக்கம் மட்டுமே நிகழ்கிறது. மிகவும் சாதகமான சந்தர்ப்பத்தில், துண்டுகள் ஒன்றுக்கொன்று மீண்டும் பூரிதமாக இருக்கலாம், ஆனால் மகசூல் சிறியதாகவும், கண்டறிதல் நிலைக்குக் குறைவாகவும் இருக்கும்.
(ஆ) தளங்களின் இழப்பு, முக்கியமாக டிப்யூரினேஷன் மற்றும் தைமிடின் டைமர் உருவாக்கம் காரணமாக, H-பத்திரங்களின் எண்ணிக்கையில் குறைவு மற்றும் Tm குறைவதற்கு வழிவகுக்கிறது. நீளமான வெப்பமயமாதல் கட்டத்தில், ப்ரைமர்கள் மேட்ரிக்ஸ் டிஎன்ஏவில் இருந்து உருகும் மற்றும் குறைவான கடுமையான நிலைமைகளின் கீழ் கூட அழியாது.
(இ) அருகிலுள்ள தைமின் தளங்கள் ஒரு TT டைமரை உருவாக்குகின்றன.
மூலக்கூறு கண்டறிதலில் அடிக்கடி நிகழும் மற்றொரு பொதுவான பிரச்சனை, ஃபீனால்-குளோரோஃபார்ம் பிரித்தெடுப்புடன் ஒப்பிடும்போது இலக்கு நியூக்ளிக் அமிலங்களின் குறைவான-உகந்த வெளியீடு ஆகும். தீவிர நிகழ்வுகளில், இது தவறான எதிர்மறைகளுடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம். கொதிநிலை சிதைவு அல்லது உயிரணு குப்பைகளை நொதி செரிமானம் செய்வதன் மூலம் அதிக நேரத்தை சேமிக்க முடியும், ஆனால் இந்த முறையானது போதுமான நியூக்ளிக் அமில வெளியீட்டின் காரணமாக குறைந்த PCR உணர்திறனை அடிக்கடி விளைவிக்கிறது.

பெருக்கத்தின் போது பாலிமரேஸ் செயல்பாட்டைத் தடுப்பது

பொதுவாக, சப்டிமல் பிசிஆர் முடிவுகளுக்கு வழிவகுக்கும் அனைத்து காரணிகளையும் விவரிக்க ஒரு கொள்கலன் கருத்தாக தடுப்பு பயன்படுத்தப்படுகிறது. ஒரு கண்டிப்பான உயிர்வேதியியல் அர்த்தத்தில், தடுப்பானது நொதியின் செயல்பாட்டிற்கு மட்டுப்படுத்தப்பட்டுள்ளது, அதாவது, டிஎன்ஏ பாலிமரேஸின் செயலில் உள்ள தளம் அல்லது அதன் காஃபாக்டருடன் (எ.கா., டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸுக்கு Mg2+) தொடர்பு மூலம் அடி மூலக்கூறு-தயாரிப்பு மாற்றத்தை குறைக்கிறது அல்லது தடுக்கிறது.
மாதிரியில் உள்ள கூறுகள் அல்லது பல்வேறு இடையகங்கள் மற்றும் வினைப்பொருட்களைக் கொண்ட சாறுகள் நொதியை நேரடியாகத் தடுக்கலாம் அல்லது அதன் காஃபாக்டர்களை (எ.கா. EDTA) சிக்க வைக்கலாம், இதன் மூலம் பாலிமரேஸை செயலிழக்கச் செய்து பிசிஆர் முடிவுகள் குறைவதற்கு அல்லது தவறான எதிர்மறையான முடிவுகளுக்கு வழிவகுக்கும்.
இருப்பினும், எதிர்வினை கூறுகள் மற்றும் இலக்கு கொண்ட நியூக்ளிக் அமிலங்களுக்கு இடையிலான பல இடைவினைகளும் 'PCR இன்ஹிபிட்டர்கள்' என குறிப்பிடப்படுகின்றன. தனிமைப்படுத்தப்பட்டதன் மூலம் கலத்தின் ஒருமைப்பாடு சீர்குலைந்து, நியூக்ளிக் அமிலம் வெளியிடப்பட்டவுடன், மாதிரிக்கும் அதைச் சுற்றியுள்ள கரைசல் மற்றும் திடமான கட்டத்திற்கும் இடையிலான தொடர்புகள் ஏற்படலாம். எடுத்துக்காட்டாக, 'ஸ்காவெஞ்சர்கள்' ஒற்றை அல்லது இரட்டை இழைகள் கொண்ட டிஎன்ஏவை கோவலன்ட் அல்லாத இடைவினைகள் மூலம் பிணைக்க முடியும் மற்றும் பிசிஆர் எதிர்வினைக் கப்பலை அடையும் இலக்குகளின் எண்ணிக்கையைக் குறைப்பதன் மூலம் தனிமைப்படுத்துதல் மற்றும் சுத்திகரிப்பதில் தலையிடலாம்.
பொதுவாக, பிசிஆர் தடுப்பான்கள் பெரும்பாலான உடல் திரவங்கள் மற்றும் வினைப்பொருட்களில் உள்ளன , கன உலோகங்கள்)

பாக்டீரியா மற்றும் யூகாரியோடிக் செல்கள், இலக்கு அல்லாத டிஎன்ஏ, டிஎன்ஏ-பைண்டிங் மேக்ரோமிகுல்ஸ் மற்றும் டிஷ்யூ மெட்ரிக்குகள் மற்றும் ஆய்வக உபகரணங்களான கையுறைகள் மற்றும் பிளாஸ்டிக்குகள் ஆகியவற்றில் மிகவும் பரவலாக PCR தடுப்பான்கள் காணப்படுகின்றன. பிசிஆர் இன்ஹிபிட்டர்களை அகற்றும் போது அல்லது பிரித்தெடுத்த பிறகு நியூக்ளிக் அமிலங்களை சுத்திகரிப்பது விரும்பத்தக்க முறையாகும்.
இன்று, பல்வேறு தானியங்கி பிரித்தெடுத்தல் கருவிகள் பல கையேடு நெறிமுறைகளை மாற்ற முடியும், ஆனால் 100% மீட்பு மற்றும்/அல்லது இலக்குகளின் சுத்திகரிப்பு ஒருபோதும் அடையப்படவில்லை. சுத்திகரிக்கப்பட்ட நியூக்ளிக் அமிலங்களில் சாத்தியமான தடுப்பான்கள் இன்னும் இருக்கலாம் அல்லது ஏற்கனவே செயல்பட்டிருக்கலாம். தடுப்பான்களின் தாக்கத்தை குறைக்க பல்வேறு உத்திகள் உள்ளன. பொருத்தமான பாலிமரேஸின் தேர்வு தடுப்பானின் செயல்பாட்டில் குறிப்பிடத்தக்க தாக்கத்தை ஏற்படுத்தும். பிசிஆர் தடுப்பைக் குறைப்பதற்கான மற்ற நிரூபிக்கப்பட்ட முறைகள் பாலிமரேஸ் செறிவை அதிகரிப்பது அல்லது பிஎஸ்ஏ போன்ற சேர்க்கைகளைப் பயன்படுத்துதல்.
PCR எதிர்வினைகளைத் தடுப்பதை உள் செயல்முறை தரக் கட்டுப்பாடு (IPC) மூலம் நிரூபிக்க முடியும்.
எத்தனால், EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol மற்றும் phenol போன்ற பிரித்தெடுத்தல் கருவியில் உள்ள அனைத்து ரியாஜெண்டுகள் மற்றும் பிற தீர்வுகளை நியூக்ளிக் அமிலம் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட ஒரு முழுமையான சலவை படி மூலம் அகற்ற கவனமாக இருக்க வேண்டும். அவற்றின் செறிவைப் பொறுத்து, அவை PCR ஐ செயல்படுத்தலாம் அல்லது தடுக்கலாம்.