PCR எதிர்வினைகளில் குறுக்கீடு காரணிகள்

PCR எதிர்வினையின் போது, ​​சில குறுக்கீடு காரணிகள் அடிக்கடி சந்திக்கப்படுகின்றன.
PCR இன் மிக உயர்ந்த உணர்திறன் காரணமாக, மாசுபாடு PCR முடிவுகளைப் பாதிக்கும் மிக முக்கியமான காரணிகளில் ஒன்றாகக் கருதப்படுகிறது மற்றும் தவறான நேர்மறையான முடிவுகளை உருவாக்கக்கூடும்.
தவறான-எதிர்மறை முடிவுகளுக்கு வழிவகுக்கும் பல்வேறு ஆதாரங்களும் சமமாக முக்கியமானவை. PCR கலவையின் ஒன்று அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட அத்தியாவசிய பாகங்கள் அல்லது பெருக்க எதிர்வினை தடுக்கப்பட்டால் அல்லது குறுக்கிடப்பட்டால், கண்டறியும் மதிப்பீடு தடைபடலாம். இது செயல்திறன் குறைவதற்கும் தவறான எதிர்மறை முடிவுகளுக்கும் கூட வழிவகுக்கும்.
தடுப்புக்கு கூடுதலாக, மாதிரி தயாரிப்பிற்கு முன் கப்பல் மற்றும்/அல்லது சேமிப்பு நிலைமைகள் காரணமாக இலக்கு நியூக்ளிக் அமில ஒருமைப்பாடு இழப்பு ஏற்படலாம். குறிப்பாக, அதிக வெப்பநிலை அல்லது போதுமான சேமிப்பு இல்லாதது செல்கள் மற்றும் நியூக்ளிக் அமிலங்களுக்கு சேதம் விளைவிக்கும். செல் மற்றும் திசு நிலைப்படுத்தல் மற்றும் பாரஃபின் உட்பொதித்தல் ஆகியவை டிஎன்ஏ துண்டு துண்டாக மாறுவதற்கும் தொடர்ச்சியான பிரச்சனைக்கும் நன்கு அறியப்பட்ட காரணங்களாகும் (படங்கள் 1 மற்றும் 2 ஐப் பார்க்கவும்). இந்த சந்தர்ப்பங்களில், உகந்த தனிமைப்படுத்தல் மற்றும் சுத்திகரிப்பு கூட உதவாது.

படம் 1 | டிஎன்ஏ ஒருமைப்பாட்டில் அசையாமையின் விளைவு
பிரேத பரிசோதனைகளின் பாரஃபின் பிரிவுகளிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட டி.என்.ஏவின் தரம் கணிசமாக வேறுபடுவதாக அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் காட்டியது. நிலைப்படுத்தல் முறையைப் பொறுத்து வெவ்வேறு சராசரி துண்டு நீளங்களின் டி.என்.ஏ சாற்றில் இருந்தது. சொந்த உறைந்த மாதிரிகளிலும், இடையகப்படுத்தப்பட்ட நடுநிலை ஃபார்மலினிலும் நிலைநிறுத்தப்படும்போது மட்டுமே டி.என்.ஏ பாதுகாக்கப்பட்டது. வலுவான அமிலத்தன்மை கொண்ட போயின் ஃபிக்ஸேட்டிவ் அல்லது இடையகப்படுத்தப்படாத, ஃபார்மிக் அமிலம் கொண்ட ஃபார்மலின் பயன்பாடு டி.என்.ஏவின் குறிப்பிடத்தக்க இழப்பை ஏற்படுத்தியது. மீதமுள்ள பகுதி மிகவும் துண்டு துண்டாக உள்ளது.
இடதுபுறத்தில், துண்டுகளின் நீளம் கிலோபேஸ் ஜோடிகளில் (kbp) வெளிப்படுத்தப்படுகிறது.

படம் 2 | நியூக்ளிக் அமில இலக்குகளின் ஒருமைப்பாடு இழப்பு
(அ) ​​இரண்டு இழைகளிலும் 3′-5′ இடைவெளி இருந்தால் இலக்கு டிஎன்ஏவில் முறிவு ஏற்படும். டிஎன்ஏவின் தொகுப்பு இன்னும் சிறிய துண்டில் ஏற்படும். இருப்பினும், டிஎன்ஏ துண்டில் ஒரு ப்ரைமர் அனீலிங் தளம் இல்லை என்றால், நேரியல் பெருக்கம் மட்டுமே நிகழ்கிறது. மிகவும் சாதகமான சூழ்நிலையில், துண்டுகள் ஒன்றையொன்று மீண்டும் நிறைவு செய்யலாம், ஆனால் மகசூல் சிறியதாகவும் கண்டறிதல் நிலைகளுக்குக் குறைவாகவும் இருக்கும்.
(ஆ) முக்கியமாக டிப்யூரினேஷன் மற்றும் தைமிடின் டைமர் உருவாக்கம் காரணமாக காரங்களை இழப்பது, H-பிணைப்புகளின் எண்ணிக்கையில் குறைவுக்கும் Tm குறைவதற்கும் வழிவகுக்கிறது. நீட்டிக்கப்பட்ட வெப்பமயமாதல் கட்டத்தில், ப்ரைமர்கள் மேட்ரிக்ஸ் டிஎன்ஏவிலிருந்து உருகி, குறைந்த கடுமையான நிலைமைகளின் கீழ் கூட அனீல் செய்யாது.
(c) அருகிலுள்ள தைமின் தளங்கள் ஒரு TT இருமரை உருவாக்குகின்றன.
மூலக்கூறு நோயறிதலில் அடிக்கடி ஏற்படும் மற்றொரு பொதுவான பிரச்சனை, ஃபீனால்-குளோரோஃபார்ம் பிரித்தெடுப்புடன் ஒப்பிடும்போது இலக்கு நியூக்ளிக் அமிலங்களின் குறைவான உகந்த வெளியீடு ஆகும். தீவிர நிகழ்வுகளில், இது தவறான எதிர்மறைகளுடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம். கொதிக்கும் சிதைவு அல்லது செல் குப்பைகளின் நொதி செரிமானம் மூலம் அதிக நேரத்தை மிச்சப்படுத்தலாம், ஆனால் இந்த முறை பெரும்பாலும் போதுமான நியூக்ளிக் அமில வெளியீடு இல்லாததால் குறைந்த PCR உணர்திறனை ஏற்படுத்துகிறது.

பெருக்கத்தின் போது பாலிமரேஸ் செயல்பாட்டைத் தடுப்பது

பொதுவாக, துணை உகந்த PCR முடிவுகளுக்கு வழிவகுக்கும் அனைத்து காரணிகளையும் விவரிக்க தடுப்பு ஒரு கொள்கலன் கருத்தாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. கண்டிப்பாக உயிர்வேதியியல் அர்த்தத்தில், தடுப்பு நொதியின் செயல்பாட்டிற்கு மட்டுப்படுத்தப்பட்டுள்ளது, அதாவது, இது DNA பாலிமரேஸின் செயலில் உள்ள தளம் அல்லது அதன் துணை காரணியுடன் (எ.கா., Taq DNA பாலிமரேஸுக்கு Mg2+) தொடர்பு கொள்வதன் மூலம் அடி மூலக்கூறு-தயாரிப்பு மாற்றத்தைக் குறைக்கிறது அல்லது தடுக்கிறது.
மாதிரியில் உள்ள கூறுகள் அல்லது பல்வேறு இடையகங்கள் மற்றும் வினைப்பொருட்களைக் கொண்ட சாறுகள் நேரடியாக நொதியைத் தடுக்கலாம் அல்லது அதன் துணை காரணிகளைப் பிடிக்கலாம் (எ.கா. EDTA), இதனால் பாலிமரேஸை செயலிழக்கச் செய்து, அதன் விளைவாக PCR முடிவுகள் குறைவதற்கு அல்லது தவறான எதிர்மறைக்கு வழிவகுக்கும்.
இருப்பினும், எதிர்வினை கூறுகளுக்கும் இலக்கு-கொண்ட நியூக்ளிக் அமிலங்களுக்கும் இடையிலான பல தொடர்புகள் 'PCR தடுப்பான்கள்' என்றும் குறிப்பிடப்படுகின்றன. தனிமைப்படுத்தலால் செல்லின் ஒருமைப்பாடு சீர்குலைந்து, நியூக்ளிக் அமிலம் வெளியிடப்பட்டவுடன், மாதிரிக்கும் அதன் சுற்றியுள்ள கரைசலுக்கும் திட நிலைக்கும் இடையிலான தொடர்புகள் ஏற்படலாம். எடுத்துக்காட்டாக, 'துப்புரவாளர்கள்' கோவலன்ட் அல்லாத தொடர்புகள் மூலம் ஒற்றை அல்லது இரட்டை இழைகள் கொண்ட டிஎன்ஏவை பிணைக்க முடியும் மற்றும் இறுதியில் PCR எதிர்வினைக் கலனை அடையும் இலக்குகளின் எண்ணிக்கையைக் குறைப்பதன் மூலம் தனிமைப்படுத்தல் மற்றும் சுத்திகரிப்பு ஆகியவற்றில் தலையிட முடியும்.
பொதுவாக, மருத்துவ நோயறிதல் சோதனைகளுக்குப் பயன்படுத்தப்படும் பெரும்பாலான உடல் திரவங்கள் மற்றும் வினைப்பொருட்களில் (சிறுநீரில் யூரியா, இரத்தத்தில் ஹீமோகுளோபின் மற்றும் ஹெப்பரின்), உணவுப் பொருட்கள் (கரிம கூறுகள், கிளைகோஜன், கொழுப்பு, Ca2+ அயனிகள்) மற்றும் சுற்றுச்சூழலில் உள்ள கூறுகள் (பீனால்கள், கன உலோகங்கள்) ஆகியவற்றில் PCR தடுப்பான்கள் உள்ளன.

பாக்டீரியா மற்றும் யூகாரியோடிக் செல்கள், இலக்கு அல்லாத டிஎன்ஏ, திசு மெட்ரிக்ஸின் டிஎன்ஏ-பிணைப்பு மேக்ரோமோலிகுல்கள் மற்றும் கையுறைகள் மற்றும் பிளாஸ்டிக்குகள் போன்ற ஆய்வக உபகரணங்களில் அதிக அளவில் PCR தடுப்பான்கள் காணப்படுகின்றன. பிரித்தெடுக்கும் போது அல்லது அதற்குப் பிறகு நியூக்ளிக் அமிலங்களை சுத்திகரிப்பது PCR தடுப்பான்களை அகற்றுவதற்கான விருப்பமான முறையாகும்.
இன்று, பல்வேறு தானியங்கி பிரித்தெடுத்தல் உபகரணங்கள் பல கையேடு நெறிமுறைகளை மாற்ற முடியும், ஆனால் 100% மீட்பு மற்றும்/அல்லது இலக்குகளை சுத்திகரித்தல் ஒருபோதும் அடையப்படவில்லை. சுத்திகரிக்கப்பட்ட நியூக்ளிக் அமிலங்களில் சாத்தியமான தடுப்பான்கள் இன்னும் இருக்கலாம் அல்லது ஏற்கனவே நடைமுறைக்கு வந்திருக்கலாம். தடுப்பான்களின் தாக்கத்தைக் குறைக்க வெவ்வேறு உத்திகள் உள்ளன. பொருத்தமான பாலிமரேஸைத் தேர்ந்தெடுப்பது தடுப்பான் செயல்பாட்டில் குறிப்பிடத்தக்க தாக்கத்தை ஏற்படுத்தும். PCR தடுப்பைக் குறைப்பதற்கான பிற நிரூபிக்கப்பட்ட முறைகள் பாலிமரேஸ் செறிவை அதிகரிப்பது அல்லது BSA போன்ற சேர்க்கைகளைப் பயன்படுத்துவதாகும்.
PCR எதிர்வினைகளைத் தடுப்பதை உள் செயல்முறை தரக் கட்டுப்பாட்டைப் (IPC) பயன்படுத்துவதன் மூலம் நிரூபிக்க முடியும்.
பிரித்தெடுக்கும் கருவியில் உள்ள அனைத்து வினைப்பொருட்கள் மற்றும் பிற கரைசல்களான எத்தனால், EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, ஐசோபுரோபனோல் மற்றும் பீனால் ஆகியவற்றை நியூக்ளிக் அமில தனிமைப்படுத்தலில் இருந்து முழுமையான கழுவுதல் படி மூலம் அகற்ற கவனமாக இருக்க வேண்டும். அவற்றின் செறிவைப் பொறுத்து, அவை PCR ஐ செயல்படுத்தலாம் அல்லது தடுக்கலாம்.