பி.சி.ஆர் எதிர்வினைகளில் குறுக்கீடு காரணிகள்

பி.சி.ஆர் எதிர்வினையின் போது, ​​சில குறுக்கிடும் காரணிகள் பெரும்பாலும் எதிர்கொள்ளப்படுகின்றன.
பி.சி.ஆரின் மிக உயர்ந்த உணர்திறன் காரணமாக, மாசுபாடு பி.சி.ஆர் முடிவுகளை பாதிக்கும் மிக முக்கியமான காரணிகளில் ஒன்றாக கருதப்படுகிறது மற்றும் தவறான நேர்மறையான முடிவுகளை உருவாக்க முடியும்.
தவறான-எதிர்மறை முடிவுகளுக்கு வழிவகுக்கும் பல்வேறு ஆதாரங்கள் சமமாக முக்கியமானவை. பி.சி.ஆர் கலவையின் ஒன்று அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட அத்தியாவசிய பகுதிகள் அல்லது பெருக்க எதிர்வினையே தடுக்கப்பட்டால் அல்லது குறுக்கிடப்பட்டால், கண்டறியும் மதிப்பீட்டைத் தடுக்கலாம். இது குறைக்கப்பட்ட செயல்திறன் மற்றும் தவறான எதிர்மறை முடிவுகளுக்கு வழிவகுக்கும்.
தடுப்புக்கு கூடுதலாக, மாதிரி தயாரிப்புக்கு முன்னர் கப்பல் மற்றும்/அல்லது சேமிப்பக நிலைமைகள் காரணமாக இலக்கு நியூக்ளிக் அமில ஒருமைப்பாட்டின் இழப்பு ஏற்படலாம். குறிப்பாக, அதிக வெப்பநிலை அல்லது போதிய சேமிப்பு செல்கள் மற்றும் நியூக்ளிக் அமிலங்களின் சேதத்திற்கு வழிவகுக்கும். செல் மற்றும் திசு சரிசெய்தல் மற்றும் பாரஃபின் உட்பொதித்தல் ஆகியவை டி.என்.ஏ துண்டு துண்டாக மற்றும் தொடர்ச்சியான சிக்கலுக்கான நன்கு அறியப்பட்ட காரணங்கள் (புள்ளிவிவரங்கள் 1 மற்றும் 2 ஐப் பார்க்கவும்). இந்த சந்தர்ப்பங்களில், உகந்த தனிமைப்படுத்தல் மற்றும் சுத்திகரிப்பு கூட உதவாது.

படம் 1 | டி.என்.ஏ ஒருமைப்பாட்டில் அசையாத தன்மையின் விளைவு
பிரேத பரிசோதனைகளின் பாரஃபின் பிரிவுகளிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட டி.என்.ஏவின் தரம் கணிசமாக வேறுபடுகிறது என்பதை அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் காட்டுகிறது. சரிசெய்தல் முறையைப் பொறுத்து சாற்றில் வெவ்வேறு சராசரி துண்டு நீளங்களின் டி.என்.ஏ இருந்தது. சொந்த உறைந்த மாதிரிகள் மற்றும் இடையக நடுநிலை ஃபார்மலினில் சரி செய்யப்படும்போது மட்டுமே டி.என்.ஏ பாதுகாக்கப்பட்டது. வலுவான அமிலத்தன்மை கொண்ட பூங்கின் நிர்ணயிக்கும் அல்லது கட்டுப்படுத்தப்படாத, ஃபார்மிக் அமிலம் கொண்ட ஃபார்மலினின் பயன்பாடு டி.என்.ஏவின் குறிப்பிடத்தக்க இழப்பை ஏற்படுத்தியது. மீதமுள்ள பின்னம் மிகவும் துண்டு துண்டாக உள்ளது.
இடதுபுறத்தில், துண்டுகளின் நீளம் கிலோபேஸ் ஜோடிகளில் (கேபிபி) வெளிப்படுத்தப்படுகிறது

படம் 2 | நியூக்ளிக் அமில இலக்குகளின் ஒருமைப்பாட்டின் இழப்பு
(அ) ​​இரண்டு இழைகளிலும் 3′-5 ′ இடைவெளி இலக்கு டி.என்.ஏவில் இடைவெளி தரும். டி.என்.ஏவின் தொகுப்பு இன்னும் சிறிய துண்டில் ஏற்படும். இருப்பினும், டி.என்.ஏ துண்டில் ஒரு ப்ரைமர் அனீலிங் தளம் காணவில்லை என்றால், நேரியல் பெருக்கம் மட்டுமே நிகழ்கிறது. மிகவும் சாதகமான விஷயத்தில், துண்டுகள் ஒருவருக்கொருவர் மறுவிற்பனை செய்யக்கூடும், ஆனால் மகசூல் சிறியதாகவும், கண்டறிதல் நிலைகளுக்கு கீழே இருக்கும்.
. நீளமான வெப்பமயமாதல் கட்டத்தின் போது, ​​ப்ரைமர்கள் மேட்ரிக்ஸ் டி.என்.ஏவிலிருந்து உருகும், மேலும் குறைவான கடுமையான நிலைமைகளின் கீழ் கூட இல்லை.
(இ) அருகிலுள்ள தைமின் தளங்கள் ஒரு டிடி டைமரை உருவாக்குகின்றன.
பினோல்-குளோரோஃபார்ம் பிரித்தெடுத்தலுடன் ஒப்பிடும்போது இலக்கு நியூக்ளிக் அமிலங்களின் உகந்ததாக வெளியீடு என்பது மூலக்கூறு கண்டறிதலில் பெரும்பாலும் நிகழும் மற்றொரு பொதுவான சிக்கல். தீவிர நிகழ்வுகளில், இது தவறான எதிர்மறைகளுடன் தொடர்புடையது. செல் குப்பைகளின் கொதிக்கும் சிதைவு அல்லது நொதி செரிமானத்தால் அதிக நேரத்தை சேமிக்க முடியும், ஆனால் இந்த முறை பெரும்பாலும் போதிய நியூக்ளிக் அமில வெளியீடு காரணமாக குறைந்த பி.சி.ஆர் உணர்திறன் ஏற்படுகிறது.

பெருக்கத்தின் போது பாலிமரேஸ் செயல்பாட்டின் தடுப்பு

பொதுவாக, துணை பி.சி.ஆர் முடிவுகளுக்கு வழிவகுக்கும் அனைத்து காரணிகளையும் விவரிக்க ஒரு கொள்கலன் கருத்தாக தடுப்பு பயன்படுத்தப்படுகிறது. கண்டிப்பாக உயிர்வேதியியல் அர்த்தத்தில், தடுப்பு நொதியின் செயல்பாட்டிற்கு மட்டுப்படுத்தப்பட்டுள்ளது, அதாவது, இது டி.என்.ஏ பாலிமரேஸின் செயலில் உள்ள தளத்துடனான தொடர்பு மூலம் அல்லது அதன் கோஃபாக்டரின் (எ.கா., TAQ டி.என்.ஏ பாலிமரேஸிற்கான எம்ஜி 2+) உடன் தொடர்பு கொள்வதன் மூலம் அடி மூலக்கூறு-தயாரிப்பு மாற்றத்தை குறைக்கிறது அல்லது தடுக்கிறது.
மாதிரியில் உள்ள கூறுகள் அல்லது உலைகள் கொண்ட பல்வேறு இடையகங்கள் மற்றும் சாறுகள் நொதியை நேரடியாகத் தடுக்கலாம் அல்லது அதன் காஃபாக்டர்களை (எ.கா. EDTA) சிக்க வைக்கலாம், இதன் மூலம் பாலிமரேஸை செயலிழக்கச் செய்கின்றன, இதையொட்டி குறைந்த அல்லது தவறான எதிர்மறை பி.சி.ஆர் முடிவுகளுக்கு வழிவகுக்கும்.
இருப்பினும், எதிர்வினை கூறுகள் மற்றும் இலக்கு கொண்ட நியூக்ளிக் அமிலங்களுக்கு இடையிலான பல தொடர்புகளும் 'பி.சி.ஆர் தடுப்பான்கள்' என்று நியமிக்கப்படுகின்றன. கலத்தின் ஒருமைப்பாடு தனிமைப்படுத்தப்பட்டு நியூக்ளிக் அமிலம் வெளியிடப்பட்டவுடன், மாதிரி மற்றும் அதன் சுற்றியுள்ள தீர்வு மற்றும் திட கட்டத்திற்கு இடையிலான தொடர்புகள் ஏற்படலாம். எடுத்துக்காட்டாக, 'தோட்டி' ஒற்றை அல்லது இரட்டை அடுக்கு டி.என்.ஏவை கோவலன்ட் அல்லாத இடைவினைகள் மூலம் பிணைக்கலாம் மற்றும் பி.சி.ஆர் எதிர்வினை கப்பலை எட்டும் இலக்குகளின் எண்ணிக்கையை குறைப்பதன் மூலம் தனிமைப்படுத்தல் மற்றும் சுத்திகரிப்பில் தலையிடலாம்.
பொதுவாக, பி.சி.ஆர் தடுப்பான்கள் பெரும்பாலான உடல் திரவங்கள் மற்றும் மருத்துவ கண்டறியும் சோதனைகளுக்கு (சிறுநீரில் யூரியா, ஹீமோகுளோபின் மற்றும் இரத்தத்தில் ஹெப்பரின்), உணவு சப்ளிமெண்ட்ஸ் (கரிம கூறுகள், கிளைகோஜன், கொழுப்பு, சிஏ 2+ அயனிகள்) மற்றும் சூழலில் உள்ள கூறுகள் (பினோல்கள், கன உலோகங்கள்) ஆகியவற்றில் பயன்படுத்தப்படுகின்றன

பாக்டீரியா மற்றும் யூகாரியோடிக் செல்கள், இலக்கு அல்லாத டி.என்.ஏ, டி.என்.ஏ-பிணைப்பு திசு மெட்ரிக்ஸ் மற்றும் கையுறைகள் மற்றும் பிளாஸ்டிக் போன்ற ஆய்வக உபகரணங்கள் ஆகியவற்றில் மேலும் பிரபலமான பி.சி.ஆர் தடுப்பான்களைக் காணலாம். பிரித்தெடுத்தலின் போது அல்லது அதற்குப் பிறகு நியூக்ளிக் அமிலங்களை சுத்திகரிப்பது பி.சி.ஆர் தடுப்பான்களை அகற்றுவதற்கான விருப்பமான முறையாகும்.
இன்று, பல்வேறு தானியங்கி பிரித்தெடுத்தல் உபகரணங்கள் பல கையேடு நெறிமுறைகளை மாற்றலாம், ஆனால் 100% மீட்பு மற்றும்/அல்லது இலக்குகளை சுத்திகரிப்பது ஒருபோதும் அடையப்படவில்லை. சுத்திகரிக்கப்பட்ட நியூக்ளிக் அமிலங்களில் சாத்தியமான தடுப்பான்கள் இன்னும் இருக்கலாம் அல்லது ஏற்கனவே நடைமுறைக்கு வந்திருக்கலாம். தடுப்பான்களின் தாக்கத்தை குறைக்க வெவ்வேறு உத்திகள் உள்ளன. பொருத்தமான பாலிமரேஸின் தேர்வு தடுப்பான செயல்பாட்டில் குறிப்பிடத்தக்க தாக்கத்தை ஏற்படுத்தும். பி.சி.ஆர் தடுப்பைக் குறைப்பதற்கான பிற நிரூபிக்கப்பட்ட முறைகள் பாலிமரேஸ் செறிவை அதிகரிக்கும் அல்லது பி.எஸ்.ஏ போன்ற சேர்க்கைகளைப் பயன்படுத்துகின்றன.
உள் செயல்முறை தரக் கட்டுப்பாடு (ஐபிசி) பயன்படுத்துவதன் மூலம் பி.சி.ஆர் எதிர்வினைகளைத் தடுப்பதை நிரூபிக்க முடியும்.
பிரித்தெடுத்தல் கருவியில் உள்ள அனைத்து உலைகள் மற்றும் பிற தீர்வுகளை அகற்ற கவனமாக இருக்க வேண்டும், அதாவது எத்தனால், ஈடா, செட்டாப், லிகல், குஸ்ன், எஸ்.டி.எஸ், ஐசோபிரபனோல் மற்றும் பினோல் போன்றவை நியூக்ளிக் அமிலம் தனிமைப்படுத்தப்பட்டவை. அவற்றின் செறிவைப் பொறுத்து, அவை பி.சி.ஆரை செயல்படுத்தலாம் அல்லது தடுக்கலாம்.